杜仲叶提取物诱导羊骨髓间充质干细胞成骨及抑制成脂肪分化的实验研究

发布于:2021-10-14 10:14:18

南昌大学医学院 硕士学位论文 杜仲叶提取物诱导羊骨髓间充质干细胞成骨及抑制成脂肪分化 的实验研究 姓名:陈伟才 申请学位级别:硕士 专业:外科学(骨外科) 指导教师:罗军 20090501

摘要


研究背景和目的:



骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenehymal stem cells,MSCs)是骨髓中的 非造血干细胞,具有自我复制能力和多向分化潜能。在不同的条件下可以诱导

分化为多个细胞系,包括成骨细胞、成纤维细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉 细胞、内皮细胞及神经细胞等。传统诱导剂只具有单纯诱导成骨或成脂的分化
作用,应用较为局限。杜仲叶提取物作为一种诱导剂,具有提高骨密度、抑制 骨吸收、调节骨代谢的药效作用,可促进成骨细胞增殖和碱性磷酸酶分泌,同 时抑制向脂肪细胞分化的作用。本实验探讨杜仲叶提取物诱导羊MSCs向成骨

细胞分化的同时,证实其具有抑制MSCs成脂肪分化的作用。 研究内容和方法: 1.采用全骨髓法体外分离培养羊骨髓间充质干细胞,常规方法进行传代培养,
流式细胞术检测CD29、CD44和CDl05进行MSCs鉴定。 2.杜仲叶提取物对MSCs的增殖及成骨分化的影响。检测ALP、*峤谌旧 观察促进成骨分化效应。 3.杜仲叶提取物抑制MSCs的成脂肪分化作用。行油红.O染色以观察抑制成脂 肪分化效应。 4.从细胞水*检测杜仲叶提取物对MSCs成骨分化后细胞Cbfa lmRNA表达的 影响,采用自动凝胶成像分析仪进行分析,观察其促进成骨分化效应。 结果: 1.采用全骨髓培养法(即贴壁法)分离纯化骨髓问充质干细胞,经换液和胰酶 消化传代后逐渐纯化,方法简单实用。
2.

与空白对照组比较,各成骨诱导组细胞内碱性磷酸酶合成增多,形成矿化结 节,且传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组、104、10巧g/mL杜仲叶提取物组诱 导成骨情况优于传统成骨诱导剂组、10击g/mL杜仲叶提取物组。

3.

油红O染色结果矬示,加入杜仲叶提取物的各成脂诱导组,其脂滴数肇明显 少于传统成脂诱导剂组和空白对照组,以10。4、10jg/mL杜仲叶提取物组效 果最佳。

4.RT—PCR显示各成骨诱导组均能高效扩增出17lbp的Cbfa 1mRNA基冈转录

摘要

片段,且104、10。59/mL浓度的杜仲叶提取物成骨细胞中Cbfa 1mRNA表达 水*差异无显著性意义(尸>0.05)。

结论: 1.杜仲叶提取物能诱导体外分离纯化培养的羊骨髓间充质干细胞向成骨细胞
方向分化增殖,同时抑制其向脂肪细胞分化,实现双向调节作用。

2.杜仲叶提取物以lO‘4、10。59/mL浓度的成骨及抑制成脂肪分化效果最佳。
3.

104、10‘59/mL浓度的杜仲叶提取物可上调Cbfa lmRNA的表达,提示杜仲 叶提取物诱导MSCs成骨分化的可能机制。

关键词:杜仲叶提取物;

MSCs;成骨分化;Cbfa

1。

Abstract

ABSTRACT

Backround and

Objective: cells(MSCs)are
bone marrow nonhematopoi-

Bone marrow mesenchymal stem

etic stem cells with self-replication ability and multilineage differentiation potential. Under different conditions
call

be induced to differentiate into multiple eell lines,

including osteoblasts,fibroblasts,cartilage cells,fat cells,muscle cells,endothelial cells and neural cells.Only the traditional agent—induced osteogenesis alone of adipogenic differentiation,which has
a or

the role

limited application.Extracting solution

from Eucommia ulmoides oliv

as an

induction agent,has to increase bone density

and

inhibit bone resorption and regulate the efficacy of the role of bone metabolism,could

promote osteoblast proliferation and alkaline phosphatase secretion,while inhibiting
fat cell differentiation to the role of.Experimental Investigation of the Eucommia leaf
extract induced

sheep MSCs

to osteoblast differentiation at

the same time,confirmed

its

inhibitory

differentiation of MSCs into the role of fat.

Contents and methods of research: 1.The
use

of the whole bone marrow in vitro isolation and culture of goat

MSCs,

conventional methods of mass culture,flow cytometry CD29,CD44 identify MSCs. 2.Extracting solution from Eucommia ulmoides oliv
on

and

CD 1 05 to

the proli feration of MSCs

and osteogenic di fferentiation.Detection of ALP,calcium staining nodules in order
to observe the effect of the

promotion of osteogenic di fferentiation.

3.Extracting solution from Eucommia ulmoides oliv MSCs inhibit the differentiation into fat.Line oil red—O staining to observe the effect of inhibiting differentiation into fat. 4.The level of detection from the cell extracting solution from Eucommia ulmoides oliv osteogenic di fferentiation of MSCs after expression of Cbfa lmRNA using automatic gel image analysis analyzer to observe its effects to promote osteoblast di fferentiation.

IV

Abstract

ResuIts: 1.Bone marrow

culture-wide(that

is,law

adherent)Isolation

and Purification of goat

MSCs by trypsin digestion for liquid and gradually purified after passage,method
is simple and practical.

2.With control
tase

group,the osteoblast cells induced by formation of

an

increase in alkaline phospha the traditional

synthesis,the

mineralized

nodules,and

agent-induced osteogenesis+extra&ing solution from Eucommia ulmoides oliv

group,1 04,1 0’59/mL extracting solution
osteoinduction
case

from

Eucommia ulmoides oliv

group supe rior

to the traditional agent—induced osteogenesis

Group,1 0~g/mL extracting solut ion from Eucommia ulmoides oliv group. 3.Oil red O staining showed that adding
extracts

of extracting solution

from

Eucommia ulmoides oliv of the adipogenic induction group,the number of lipid
droplets significantly less than traditional adipogenic induction agent group

and

blank control group to 1 0-4,1 0—59/mL extracting solution from Eucommia ulmoides oliv group best. 4.RT-PCR showed that the osteoblasts induced by high-performance group were

amplified the 1 7 1 bp fragment of gene transcription Cbfa l mRNA and 1 0-4,1 0。59/ mL
concentration of extracting solution

from

Eucommia

ulmoides

oliv

in

osteoblasts the expression level of Cbfa lmRNA the difference was not

significant

(P>0.05).
Conclusion: 1.Extracting solution from Eucommia ulmoides oliv culture of sheep
can

be induced by in vitro

separation

and puri fication of bone marrow mesenchymal stem

cells to the direction of osteoblast differentiation and proliferation,while inhibiting their di fferentiation to adipocytes,the role of two—way

adj ustment.

2.Extracting solution from Eucommia ulmoides oliv to 10-4 10。59/mL concentration of osteoblasts and inhibit differentiation into fat best. 3.10-4,10—5 g/mL concentration ofextracting solution from Eucommia ulmoides oliv
can

increase the expression of Cbfal mRNA,suggesting extracting solution from


Eucommia ulmoides oliv—induced osteogenic differentiation of MSCs may be mechani sm



Abstract

Key words:Extracting solution from Eucommia ulmoides oliv;MSCs;Osteogenic
differentiation;Cbfa 1.

VI

中英文缩写词表

中英文缩写词表

英文缩写
MSCs
Cbfa l
core

英文全称
mesenchymal stem cells
binding facto,r-a 1

中文全称
骨髓间充质干细胞 核心结合因子a 骨髓细胞 逆转录PCR 骨形态发生蛋白 股骨头坏死 骨保护蛋白


BMCs
RT—PCR

bone marrow cells
reverse

transcripation—PCR

BMP
0NFH OPG

Bone morphogenetic protein osteonecrosis of the femoral head Osteoprotegerin

Peroxisome proliferator-activated
PPAR'I/2

过氧化物酶增殖体激活
受体位 地塞米松 造血干细胞 骨髓干细胞 碱性磷酸酶 口.甘油磷酸钠

receptor-lc2
Dex HSCs

Dexamethasone
hematopoietic stem cells bone marrow stem cells Alkaline phosphatase

BMSCs
ALP

伊GP
EDTA FBS/FCS PBS

/3-glicerophosphate ethylenediamine tetraacetic acid
fetal bovine/calf serum phosphate buffered saline extracellular matrix protein

乙二胺四乙酸
胎牛血清 磷酸盐缓冲液 骨细胞外基质蛋白 转化生长因子一口 多瘤病毒增强子结合蛋 白2aA 胰岛素样生长因子 成纤维细胞样克隆形成 单位 骨桥蛋向 急性骨髓性白血病因子3 转化乍长因子一口1 基州莺组人BMP2 二乙基焦磷酰胺

ECMP TGF一口
pebp 2aA IGF CFU—F oPN

Transforming growth factor-beta
polymavirus enhancer binding protein 2aA Insulin—like gowth factor Fibroblast

Colony-Forming

units

Osteopontin
aeute

AML3
TGF—pl rhBMP2
DEPC

myeloid leukaemia3

Transforming growth factor—B1 recombinant human BMP2 gene diethyl pyrocarbonate

学位论文独创性声明

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本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的

研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含

其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得南昌大学或其他教育
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贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

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本学位论文作者完全了解

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少6乡年b月tr日

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第1章引言

第1章
股骨头坏死(osteonecrosis

引言
ONFH)是骨科常见病、多发

of the femoral head

病,是一种进展性和致残性疾病,主要发生在30"-'50岁的中青年,约有半数累

及双侧股骨头,是对髋关节具有特殊破坏性的退行性病变,最终导致髋关节功 能*现赜跋旎颊呱钪柿浚斐沙林氐募彝ズ蜕缁岣旱!F浞⒉』频 学说有很多,但目前尚未完全阐明,因此治疗比较困难。祖国中医药对早期ONFH 具有独特的疗效,而对中晚期ONFH多采用手术治疗,如人工髋关节置换术等,
虽然有效,但具有一定的使用寿命,远期需要翻修,不适合年轻患者,且手术创 伤大,费用高,常造成治疗的**年来,MSCs移植治疗ONFH的效果得到 肯定。而祖国中医药对ONFH具有独特的疗效,利用我国特有的中医理论和中草

药资源,结合现代干细胞治疗技术,有望从根本上实现对ONFH的治疗。 ONFH又称股骨头无菌性坏死或股骨头缺血性坏死,是骨坏死的一种,由于 多种病因破坏股骨头的血供,使骨的活性成分(包括骨细胞、骨髓细胞和脂肪
细胞)死亡所引起的一个病理过程,最终导致整个髋关节功能丧失。供应成人 的股骨头和股骨颈的主要动脉是旋股内侧动脉和旋股外侧动脉发出的分支所形 成的支持带动脉,骨坏死是多种原因导致的股骨头支持带血管损伤,骨基质的 缺血变性而坏死,进一步发展致股骨头塌陷和囊性变,继发关节软骨退行性变、 骨赘形成、骨性关节炎而致髋关节功能丧失,若治疗不及时,最终可导致残疾。

缺血性股骨头坏死可以分为两类:①创伤性股骨头坏死,为骨坏死的常见病因。 经颈股骨颈骨折、创伤性髋关节脱位、股骨头骨折均可引起oNFH;②非创伤性
的股骨头坏死,主要见于长期服用糖皮质激素、酒精、减压病、*系统疾病、 病毒感染等。不论何种原因,其共同的致病机理均为股骨头血流量逐渐下降引 起骨髓组织缺氧,继而组织水肿,进一步使骨髓内高压,形成恶性循环,从而 导致骨缺m坏死、脂肪化的发生,最终股骨头塌陷。 分子水*研究表明,糖皮质激素既可通过抑制骨形态发生蛋白(BMP)和 核心结合冈子al(Cbfa 1)以及渊箝细胞J上J期来影响成骨细胞增殖和分化lI'z J,促 进MSCs分化为脂肪细胞,抑制其分化为成骨细胞,又可通过对破骨细胞的活化 作用导致骨的溶解吸收,从而使得骨组织强度下降,发生应力性股骨头塌陷。 目前,已经发现很多对破’F门il’细胞的功能起调节作用的细胞因了,而骨保护蛋白

第1章引言

(OPG)、NF.KB受体活化因子(RANK)、NF.KB受体活化因子配体(RANKL) 组成的OPG/RANK/RANKL信号转导系统对于破骨细胞的成熟、分化及功能发
挥起重要的作用131,糖皮质激素通过下调OPGmRNA的表达,提高RANK和

RANKL的结合水*,从而增加破骨细胞的生成和活性,造成大量的骨质破坏。

激素性股骨头坏死另一条调控途径是Cbfa卯P删。过氧化物酶增殖体激活受
体位(PPAR-/2)主要存在于脂肪细胞,可引起MSCs向脂肪细胞分化,核心结合
因子al(Cbfa 1)是诱导成骨细胞转录的特异性因子【4】,糖皮质激素通过上调
PPAR?2 mRNA的表达和下调Cbfa l

mRNA的表达而抑制成骨细胞分化,促进

MSCs向脂肪细胞分化,髓腔内脂肪填塞导致股骨头*循环*钩晒窍赴
分化、增殖能力下降。 骨髓中只含有少量的间充质干细胞,在新鲜骨髓中MSCs占有核骨髓细胞的

0.0001%~O.01%【5,6】,并随年龄的增加而减少。体外单层培养的间充质干细胞外 形类似成纤维细胞,呈长梭形,体积较大。原代细胞接种贴壁后,经过2"---4天 的潜伏期开始迅速地克隆性扩增,类似旋涡状盘旋排布,10"---14天可接*融合, 经传代的细胞形态更一致,对数增长期细胞倍增时间为33"一38dx时。 MSCs主要的生物学特性有:①增殖扩增能力。Colter等【7】报道极低密度培养
能保持MSCs的增殖能力,20ml的骨髓样本经3代6周的培养可扩增2x109倍,达

1013个细胞,相当于成年人体细胞总数。②多向分化潜能,是最重要的生物学特 性。例如采用地塞米松,伊磷酸甘油和抗坏血酸等作为诱导因子,MSCs可以分化为
骨细胞,形成聚集体或骨结节【8l,MSCs的成骨分化在不同时期受不同干预因素调

节,并表达不同的基因产物。各调节因素之间的调节效应可以协同、拈抗,或
为交互性,形成一个复杂的、具有时间和空间特征的调节网络。简单的说可以

归纳为化学、生物、物理三种主要因素。化学因素:主要指常规成骨诱导剂,
如地塞米松(Dexamethasone,Dex)、伊甘油磷酸钠(/5-glicerophosphate,p—GP)、 维生素C(Vitamin,VitC)I 91。目前普遍认为Dex是诱导MSCs矿化时所必须,它在 体外诱导MSCs向成骨细胞分化过程中起着重要作用l】Ⅲ。DeX可诱导MSCs分化 表达骨桥蛋门(Osteopontin,OPN),增加l型胶原mRNA,提高MSCs对一甲状旁 腺激素和自,J.列腺素E2反应的cAMP水*,同时还可以调节成骨样细胞合成胰岛素 样生长凶子(Insulin‘like
gowth factor,

IGF)干I促进胶原合成的作用,刺激其碱

性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性。伊GP提供磷离子作为ALP作用的底 物,诱导和激活ALP,促进有机磷向无机磷转化,并加速钙盐沉着。研究证实…】,


第1章引言

VitC可以诱导MSCs的ALP活性,促进成骨标记蛋白的表达,钙的沉积,矿化结 节的形成;生物因子:生物因素指各种生长因子与MSCs骨向分化相关的生长因子 有核心结合因子al(core
binding factor 1,Cbfa

1)、骨形态发生蛋白(Bone

morphogenetic proteins,BMP)、转化生长因子一p(Transforming growth factor-beta,

TGF.国等,其中,Cbfal是公认的促进成骨细胞分化的转录因子,对成骨特异性 基因表达及在成骨分化中起调节作用,它能在非成骨细胞或成骨前体细胞中上
调成骨分化相关基因的表达【l,4】,在鼠颅骨来源的非分化细胞MC3T3E.1,瞬时转 染Cbfal能明显上调I型胶原、骨桥素、骨钙素表达【12】,Cbfa 1基因敲除纯合子

小鼠完全缺乏骨组织,骨内无矿化中心出现;物理因素:物理因素在MSCs骨向分
化中可能起到一定的作用,成为研究MSCs骨向分化过程中一个切入点。韩立赤
【l

3】研究报道单一周期性张应力刺激下,骨分化相关因子IGF.II、TGF.p在MSCs

中表达增强,其中多数基因表达在力学刺激后6h达到峰值,这些因子的高表达

反过来诱导MSCs成骨分化。在DMEM.HG培养液中加入地塞米松、胰岛素、
TGF.pl等可诱导MSCs分化成软骨细胞【M】;在培养液中加入l一甲基一3一异丁基

黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛后,则细胞内含脂丰富的小泡逐渐增多,即
分化成脂肪细胞【1 5】等。间充质干细胞来源于中胚层,是外胚胎发育早期阶段的 细胞成分,人体中,由中胚层生发而来的组织器官很多,如骨、软骨、脂肪、

肌肉、肌腱、真皮等组织。间充质干细胞与这些组织有起源上的相关性,具有 分化出这些组织的潜能。在适宜的体内或体外环境下,MSCs不仅可以分化为间
充质组织,还可以分化为神经系统、肝脏、肺、上皮组织等,正是由于间充质 干细胞具有以上生物学特性,奠定了临床应用的坚实基础。

中医认为,ONFH当属“骨痹”、“骨痿”、“骨蚀”、“髋骨痹”、“历节风”等范畴。
邓沂等11 6J则认为“骨痹”、“骨痿”、“骨蚀”是ONFH的不同发展阶段、不同病理改 变、不同证侯表现的相应病名,即早期以瘀血、气血闭阻为基本病机,称之为“髋

骨痹”、“骨痹”;晚期有股骨头塌陷、缺损,称之为“骨蚀”;而早期与晚期之间
有髓减骨枯,筋骨痿软,则称之为“骨痿”,较符合临床实际,更具有中医药特色。 一般认为,ONFH的内因有先大不足、肝肾亏虚、气血不足;外因有邪毒、外伤、 湿热等侵犯经络,导致气血痹阻、髓海瘀滞、髓死骨枯。 杜仲(Eucommia ulmoides oliv)系杜仲科杜仲属植物,是仅存r中国的第3纪 孑遗植物,杜仲作为中药在困内已有2000年的药用历史,丰要以杜仲皮入药, 具有补肾、强筋健骨的作用,杜仲叶含有与杜仲皮相似的化学成分,药效作用


第1章引言

亦相同f17.1 81。杜仲叶醇提取物主要含有绿原酸、多酚、黄酮类等成分【19】,具有 提高骨密度、抑制骨吸收的作用【201,胡金家等【21】将杜仲叶提取物与成骨细胞共
同培养,结果杜仲叶提取物具有明显调节骨代谢功能的药效作用,可促进成骨

细胞增殖和碱性磷酸酶分泌,防止骨质疏松的作用,Lee GW等【ZzJ研究发现,杜 仲提取液具有抑制MSCs向脂肪细胞分化的作用,这是其防治骨质疏松的主要机 制之一。杜仲在治疗骨坏死性疾病方面有其独特疗效,其主要作用机制:①提 高成骨细胞的活性,促进骨细胞的分化和增殖:②促进毛细血管再生,改善局 部微循环;③防治骨质疏松;④补充骨折所需要的微量元素,加速骨痂的改建 等。但是,到目前为止,成骨诱导剂只具有单向调节作用,即诱导MSCs向成骨 细胞方向分化,然而,杜仲不仅能提高成骨细胞的活性,促进骨细胞的分化及 增殖【231,而且能抑制MSCs向脂肪细胞的分化作用,从而为杜仲治疗股骨头坏死提 供了理论依据。 本课题采用杜仲叶提取物诱导MSCs成骨分化和抑制其成脂肪分化,同时 与传统诱导剂进行比较,观察其成骨分化效应和抑制成脂肪分化效应,为进一 步进行体内动物试验奠定理论基础。



第2章材料与方法

第2章材料与方法
2.1
2.1.1

实验材料 实验动物

健康12月龄羊6只,雌雄各半,由南昌大学提供,实验过程中对动物的处置 符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

2.1.2实验试剂
杜仲叶提取物(江西师大生物技术公司)
高糖DMEM、胰蛋白酶(Gibco公司 美国)

地塞米松、伊甘油磷酸钠、抗坏血酸(Sigma公司) RT-PCR试剂盒(北京天根公司) 胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物有限公司) 青一链霉素(Penicillin.Streptomycin)(Gibco公司 美国)

琼脂糖(Agarose spain)(北京欣经科生物技术公司)

吐温.80、巴比妥钠、油红O(上海国药集团化学试剂有限公司)
多聚甲醛(广州化学试剂厂) 异丙醇(上海试四赫维化工有限公司) 无水乙醇(天津市恒兴化学试剂制造有限公司) 丙酮(上海炎晨化工实业有限公司) 硝酸钴、硫代硫酸钠(天津市福晨化学试剂厂) 硝酸银(上海化学试剂有限公司) 硫化铵(上海统亚化工科技发展有限公司)

2.1.3主要仪器

超净T作台(中国苏净集团安泰公司) C02细胞培养箱(Forma公司 倒置相差显微镜(Olympus公司 美罔) f1本)

第2章材料与方法

低温台式离心机(Sigma公司

德国)

水*电泳仪(中国北京六一仪器厂)

WFH.201B紫外反射透射仪(上海精科实业有限公司)
数码相机(Nikon公司 .80℃冰箱(Forma公司 日本) 美国) 德国)

聚合酶链式反应(PCR)仪(Biometra公司

电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂有限公司’)
PH计(Mettler-Toledo公司
FACS

瑞士)
美国)

Calibur流式细胞仪(BD公司

2.2实验方法 2.2.1器材的准备
(1)灭菌消毒:所用玻璃器具均经硫酸、重铬酸钾清洁液浸泡,充分洗涤,用 三蒸水冲洗后于60℃烘干,然后160℃干热消毒2h;所用塑料器材清洗干净后, 用三蒸水冲洗后于60。C烘干,再120"(2高压灭菌;所有金属手术器械均在戊二
醛内浸泡消毒。 (2)去RNA酶处理:所用的EP管、枪头、等塑料器材和水溶液均为0.I%DEPC 处理过夜,烘干后120℃高压灭菌处理;试剂为新丌瓶或DEPC水配制;金属、 玻璃用品经250℃干烤4h。

2.2.2骨髓间充质干细胞(bone 的分离培养与鉴定
2.2.2.1

marrow mesenehymal stem

cells,MSCs)

MSCs的分离培养

(1)原代培养:采用全骨髓法进行分离培养。无菌抽取羊髂骨骨髓,加入约为
骨髓体积l:1"--2:l的无血清培养笨,在1000 r/min离心10 min,弃去上清液, 将下面细胞层(含MSCs的混合物)用完全培养基再悬,移入一次性塑料培养

瓶中,加入含体积分数为l 5%胎牛血清的DMEM培养基制成细胞恳液,调整细
胞浓度约为l×108/L,置f 37℃、5%的C02、饱和湿度孵箱中培养。原代培养 48h后首次半量换液,以后每3d换液一次。 (2)传代培养:当细胞生长争瓶底血i积80%--一90%时,吸去培养液,用PBS洗



第2章材料与方法

1次,2.59/L胰酶+O.01%EDTA消化,把消化后的培养瓶放置显微镜下进行观察, 发现胞质回缩、细胞问隙增大并开始脱落时加入含FBSl5%的培养液中止消化, 按1:3分装至三个培养瓶中,置37℃温箱中继续培养。

(3)诱导分化:根据实验设计,取第3代MSCs进行实验,传代24h后分别更
换相应实验组诱导剂进行诱导培养,采用培养瓶或六孔板两种器皿进行诱导培 养。
2.2.2.2

MSCs细胞表面标志的鉴定

将分别采用普通培养基和条件培养基培养的同一组细胞用胰酶消化后,PBS
洗涤,1000rpm离心5"~10min,共3次,计数细胞约3x106/ml,分别加入荧光标 记抗体,避光30min,加入PBS 1000rpm离心5~10min,洗去未标记的抗体,弃 上清,1%多聚甲醛固定,用美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪检测。

2.2.3杜仲叶提取物实验试剂的配制
称取100 mg杜仲叶提取物(干质量),加入10#L吐温.80,搅拌均匀以充分溶 解,加入DMEM液lmL,再次搅拌均匀,然后逐渐5bIDMEM液至10mL,充分溶解 过滤除菌,配成含杜仲叶提取物10-29/mL作为母液。取lmL母液,加入DMEM液 配成含杜仲叶提取物10—g/mL,混匀后同法依次配成含杜仲叶提取物lO。4、lO一、 10西g/mL的不同质量浓度的试剂,4℃保存备用。

2.2.4实验分组
2.2.4.1

成骨实验分组:为检测杜仲叶提取物的成骨效应以及不同浓度的杜仲叶

提取物的成骨效应差别,取第3代骨髓间充质干细胞,接种于25cm2玻璃培养瓶,
24

h后更换加入相应诱导剂的培养液,设立6组:空白对照组(A组),加入

DMEM+15%胎牛血清;传统成骨诱导剂组(B组),加入含10’8 mol/L地塞米松、
10

mmol/L伊}{‘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸的DMEM高糖培养基【24J;传统成

骨诱导剂+杜仲叶提取物组(10巧g/mL)(C组),在传统诱导剂组基础上加入 10’59/mL杜仲叶提取物f25J;lO一、lO一、10—69/mL杜仲叶提取物组(分别设为D、 E、F组)分别加入对应质量浓度的杜仲叶提取物。传代24h后分别更换相应实 验组诱导剂进行诱导培养,每3d换液1次,培养2周后行成骨检测和RT-PCR 检测。 2.2.4.2成脂实验分组:‘j成骨实验分组基本相『司,仪将B组传统成骨诱导剂更

第2章材料与方法

换为改良伊格尔成脂诱导剂|26】,即含10’8mol/L地塞米松、10mg/L胰岛素、100 U/L青霉素、100 m∥L链霉素、体积分数为15%胎牛血清的DMEM高糖培养基,

C组更换为改良伊格尔成脂诱导剂+杜仲叶提取物(10~g/mL),传代24h后分别 更换相应实验组诱导剂进行诱导培养,每3d换液1次,培养3周后行成脂检测。

2.2.5碱性磷酸酶染色(钙钴法)
从细胞培养板中取出细胞爬片,PBS冲洗后,用冷丙酮固定10min,蒸馏水 冲洗数次,加孵育液(配制方法:3%伊甘油磷酸钠10 mL,2%巴比妥钠10 mL,蒸
馏水5 mL,2%无水CaCl2
20

mL,2%MgSOa



mL,pH=9.4),37。C孵育4"-'6

h,

自来水冲洗数次,加1%硫化铵染2min,自来水冲洗,自然干燥,甘油封固。胞 质中阳性反应为出现棕褐色颗粒或块状沉淀。
2.2.6 Von

Kossa法矿化结节染色

从细胞培养板中取出细胞爬片,PBS冲洗2次,用冷丙酮固定10min,蒸馏 水冲洗3次,加入2%硝酸银置暗处1 h,蒸馏水冲洗3次,再用流水冲洗10
min,

5%硫代硫酸钠(配制方法:硫代硫酸钠59,氢氧化钠0.2ml,蒸馏水100m1)还
原l h,自然干燥,甘油封固。染色后出现黑色矿化结节为阳性反应。

2.2.7油红。染色 采用6孔板内直接爬片,成脂诱导3周的细胞行油红O染色,以PBS洗涤
3次,40∥L多聚甲醛固定,一204C过夜,12h后去除6孔板内固定液,PBS轻轻 洗涤细胞玻片3次,每孔加入3∥L油红0(油红0染液的配SU.-称取油红O粉 剂0.59,溶解于100ml异丙醇中,充分溶解后作为染色原液,临用时取染色原

液6ml,加蒸馏水4ml稀释,静置5~10min定性滤纸过滤后使用)2ml,密闭后
静置37℃染色2 h,PBS反复多次冲洗,苏木素复染胞核30s,再次PBS反复多

次漂沈,自然干燥,甘油封同。染色后出现红色脂滴为阳性反应。
2.2.8 Cbfa

l引物设计与合成

Cbfa

1引物设计参照文献Iz 71,其引物序列见表2.1,以B-actin作为PCR的

内参,引物由卜海捷瑞fl物f:程仃限公司合成。

2.2.9细胞总RNA提取及鉴定



第2章材料与方法
2.2.9.1

总RNA提取
Total

严格按照TRNzol

RNAReagent说明书进行,具体步骤如下:

①取1.0×108个MSCs,离心后倒掉上清,加入1.0ml的TRNzol试剂,室 温下用枪头反复吹打使其充分裂解,移入1.5ml去RNA酶的EP管中。 ②加入0.2ml氯仿,盖紧盖子剧烈震荡EP管15秒,室温静置3min。 ③4"C,12000rpm,离心10.15min,可见分成上(RNA)中(蛋白)下(DNA)


三相。

④将上层水相约o.5 ml转移入另一新的EP管中,加入0。5 ml异丙醇,混
匀后室温静置20.30rain。

⑤4"C,12000rpm,离心10min,管底可见白色的RNA沉淀。 ⑥弃上清,加入75%乙醇1.0ml(DEPC处理过的水配制)洗涤沉淀,4"C,
5000rpm,离心3min。

⑦弃上清,空气中干燥RNA沉淀,至不完全干燥时,加入30.0.100.Opl 水溶解。

DEPC

⑧样本RNA取少许稀释100倍后,以核酸蛋白分析仪测定OD260、OD280 及OD260/OD280值,计算RNA的纯度和浓度,.70。C保存备用。
2.2.9.2

RNA质量鉴定

以DEPC处理的蒸馏水配制PH7.0磷酸钠缓冲液及加样缓冲液;电泳槽和 上样梳等用具用去污剂洗净后,70%乙醇冲洗,干燥后以3%H202浸泡4h,无菌
DEPC水彻底冲洗;以磷酸钠缓冲液制备1.O%琼脂糖(含Goldviewnal型核酸染

色液1.5%(w/v)),取5.0#1总RNA及5.0/.d上样缓冲液上样电泳,待溴酚兰指示 剂迁移约8.0cm时,终止电泳,紫外透射仪观察5S,18S,28S条带的完整性。

2.2.10半定量RT-PCR测定Cbfa I mRNA表达水*
2.2.10.1

cDNA的合成
RT

参照TIANScript

Kit逆转录试剂盒说明书,取总RNA

5肚,oligo

2/xL, min,

dNTP 2#L,RNase.Free ddH20

4.5#L,70℃加热5 min后迅速在冰上冷却2

)JIA.5×FirSt—Strand

Buffer 4pL,0.1 mol/L DTT I#L,RNasin O.5#L,TIANScript

M.MLV l#L(200 U),42℃温浴50 min后,95℃加热5 min终LE反心,加入
RNase.Free ddH20

30#L,反转录cDNA结束。合成的cDNA,置.70℃保存备用。



第2章材料与方法
2.2.10。2

PCR扩增

取cDNA 5#L,上游引物lgL,下游引物lgL,2xMaster Mix
RNase.Free

12.5肛,加

ddH20配成25#L反应体系,依表2.2反应条件进行扩增,反应最后

在72℃下延长10min。扩增产物经含Goldviewnal型核酸染色液的1.5%(w/v)琼

脂糖凝胶电泳检测,自动凝胶成像分析仪分析。
表2.1弓IS的序列和预期产物K度 基冈名称
Cbfa l forward
reverse

引物序列
5’.GAT GAC ACT GCC ACC TCT GA一3’ 5'-GAC TGG CGG GGT GTAAGT AA.3’ 5’一CCT CGC CTT TGC CGA TCC.3’ 5’.GGA TCT TCA TGA GGT AGT CAG TC.3’

产物人小(bp)
17l

B-actin

forward
reverse

240

2.3统计学处理
应用统计软件SPSS


1.0进行统计分析,数据资料用均数与标准差(叉士s)

表示。两组均数间差异检验采用小样本t检验;多组均数间差异检验采用F检验, 两指标间相关性分析采用LSD.t检验,统*峁裕校迹希埃滴邢灾庖濉

10

第3章结果

第3章结果
3.1羊MSCs形态学观察
倒置相差显微镜下观察,原代培养的细胞含有较多的红细胞,培养48h后 首次半量换液。第二次换液时倒掉不贴壁细胞(大量的红细胞),可见有少许细

胞集落及己贴壁的圆形和短梭形的散在单个细胞。培养初期:培养物以造血细
胞成分居多,随培养时间延长,这些细胞逐渐坏死、破碎或随换液而清除掉。 培养24h后:骨髓中体积较大的单个核细胞变形贴壁。培养48h后:贴壁细胞 体积增大,数量增多,部分区域形成细胞团簇,呈成纤维样细胞外观(照片3.1
A、

B),以后这些细胞呈克隆生长,5~7d后,部分区域形成细胞团簇,细胞呈现成 纤维细胞梭形外观,有较多突起,胞核明显,呈卵圆形,可见1~3个核仁,胞 质丰富、清晰。生长期细胞分裂相多见细胞突起互相联接。培养12----,24 d:细 胞汇合成层,无黏附性的细胞经换液或传代而去除,骨髓间充质干细胞得以纯

化,此时细胞呈栅栏状及旋涡状生长(照片3.1 C、D)。传代细胞接种后1~2h
开始迅速贴壁,伸展,重新恢复成梭形,24h基本完成贴壁,细胞呈均匀生长, 细胞形态更加单一,7~8d铺满瓶底。传代后的次代细胞形态与前代基本相同, 但增殖速度明显增快。诱导后:杜仲叶提取物和传统成骨诱导剂诱导后的细胞 出现与成骨细胞相似的形态学特征,但胞体增大,细胞外基质分泌增多,细胞增 殖速度加快。

3.2羊MSCs流式细胞术检测
流式细胞术检测显示培养的细胞表型不够均一,但随着培养时间的延长, 细胞表型均一性提高。涛导培养l周后,CD29和CDl05的阳性率分别由原来的 63.52%、71.16%提高至4J96.02%、91.18%,而CD44[gf:t性率略有下降,由62.15%下 降为52.07%,CDl4、CD34无表达,HLA—DR极弱表达,分别为1.59%¥t11.62%。 未经条件培养基诱导的对照组细胞,CD29和CDl05的阳性率以及CDl4、CD34 和HLA—DR的阴性率与诱导终l相似,但CD44的阳性率由72.36%上升至1199.01%。 结果显示所分离培养的细胞为MSCs,而非造血于细胞(图3.1)。

第3章结果

∞羔

瓷£o一&巳2
ool
1矿

{i百兰
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案篓吖

a.阴性对照

b.CD29阳性率96.02%,CDl4无表达

0111●;G'

舶耐%G枷d
uL ,.'3



Ul

5'∞
7.’53 ●口2S

c.CD44阳性率52.07%,CDl05阿I性率91.18%d.HLA.DR的阳性率1.62% 图3.1流式细胞术检测体外培养第4周和诱导2周的MSCs表面标志抗原表达

3.3碱性磷酸酶(ALP)染色结果
骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后,光镜下可见胞核颜色较淡,胞浆色变深,

胞浆内有浅棕色至棕褐色颗粒出现,呈梭形和多角形,有些融合成片状、块状, 与细胞形态相似。准备6块玻片,每片随机取2个视野,采用网格计数法,计
算ALP阳性表达率。与空白对照组(照片3.2 A)比较,各诱导组细胞内染色颗 粒粗大,颗粒之I’日J的间隙小,且传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组(照片3.2
C)、

lOq、10。g/mL杜仲叶提取物组(照片3.2 D、E)诱导情况优于传统成骨诱导剂 组(照片3.2 B)、10哪g/mL杜仲叶提取物组(照片3.2 F),P<O.05,有显著统计 学意义;传统成骨诱导剂组与1019/mL杜仲叶提取物组比较,P>0.05,无统计 学意义;lO_、10-ag/mL杜仲叶提取物组相比较,P>O.05,无统计学意义(表
3.1,图3.2)。

12

第3章结果 表3.1不同实验组*均碱性磷酸酶染色阳性表达率(一X 4-¥,n=6) ALP阳性表达率 0.1013士0.0837
0.4593-t=0.1216

组别 空白对照组 传统诱导组 4#.e壳N+lO巧g/mL杜仲叶提取物组(10巧edrrlL) 104幽nL杜仲叶提取物组 10巧g/mL杜仲叶提取物组 10击g/rnL杜仲叶提取物组

0.7546士0.1 700 0.7306士0。1 828
?0.7052-tz0.1 728

0.4330士0.1 053

图3.2不同实验组*均碱性磷酸酶染色刚性表达率的比较

3.4矿化结节染色结果
骨髓问充质干细胞成骨诱导2周后,光镜下可见细胞聚集成多个散在的细胞 结节,结节中间的细胞由梭形变为矮立方形或锥体形,排列紧密,逐渐形成多 层结构,并产生大量分泌颗粒,将结节包埋,结节中心部逐渐变浓,直至不透 光,细胞外基质出现黑色的闭块状结节,周围有放射状突起,表明细胞聚集生长, 逐渐形成矿化结节。在低倍镜视野(50x)一*锌蠡峤诩剖靠紫赴婊剖 个视野的矿化结节数。空白对照组矿化结节形成不明显(照片3.3 A),传统成骨 诱导剂组(照片3.3 B)与10”g/mL杜仲叶提取物组(照片3.3 F)可见矿化结节, 但结节直径较小、数量较少,传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组(照片3.3
C)、

lO一、10。Jg/mL杜仲叶提取物组(照片3。3 D、E)矿化结节直径大、染色深、数 量多,与空白组、传统成骨诱导剂组及10-ug/mL杜仲叶提取物组比较,P<0.05, 有显著统计学意义;传统成骨诱导剂组与10-og/mL杜仲叶提取物组比较,P>

第3章结果

O.05,无统计学意义;104、10-Sg/mL杜仲叶提取物组相比较,P>O.05,无统计
学意义(表3.2,图3.3)。
表3.2不同实验组矿化结节数(又士s,n=6)

组别 空白对照组 传统诱导组 传统组+10巧g,'mLC'-J:仲叶提取物组(10。59/mL)
1 1

矿化结节数 1.40十0.440 5.20七1.170 7.50士1.510
7.90_-1::1.690

04咖L杜仲叶提取物组
0巧g/mL#d:仲叶提取物组

7.20士1.320 4.10十1.080

10击g/mE杜仲叶提取物组

图3.3不同实验组矿化结节数的比较

3.5油红。染色结果
成脂诱导后的细胞逐渐变为圆形、椭圆形。5d左右后光镜下可见胞浆内出 现黄色的折光性强的圆形的小脂滴,随着诱导时I'BJ的延长,脂肪细胞的比例逐

渐增高,小脂滴逐渐增多融合成大脂肪滴,细胞核被脂滴挤于一侧,细胞问质也
町见散住脂肪滴,且脂滴富集于核周形成“戒坏”样形状,呈典型的成熟脂肪细 胞特征,细胞多聚集成堆形成细胞集落。诱导分化第2l天,染色前光镜F大体 观察A组(照片3.4 A)与C组(照片3.4 C)可见折光性脂滴,B组脂滴最多 (照片3.4 B),D、E组(照片3.4 D、E)末见明显脂滴,而F组(照片3.4 F) 可见散在的小脂滴,但较A、B组少。油红O染色后脂滴呈红色,B组细胞胞
14

第3章结果

浆内及细胞间质中可见大量小圆形及有折光性的油脂滴形成,并可见大量相互 融合的脂肪小球。染色后可见,传统成脂诱导剂组大量细胞的胞浆内有脂滴出 现,脂滴体积大而密集,可见大量脂肪小球(照片3.5 B),偶可见脂肪空泡(照 片3.5 G);传统成脂诱导剂+杜仲叶提取物组细胞胞浆内及细胞外的脂滴情况相 当,为小脂滴,偶见脂肪小球,与空白对照组(照片3.5 A)相当,但数量明显 少于传统成脂诱导剂组(照片3.5 C);10…g/mL杜仲叶提取物组次之(照片3.5 F);‘10m、10。Jg/mL杜仲叶提取物组仅有部分细胞的胞浆内出现脂滴,脂滴体积 明显缩小且散在分布(照片3.5 D、E)。油红O染色结果显示,加入杜仲叶提 取物的各成脂诱导组,其脂滴数量明显少于传统成脂诱导剂组,染色后镜下大 体观察油红量结果为:B组脂肪细胞最多,A组、C组和F组次之,E组和D组 脂肪细胞最少。

3.6羊MSCs诱导后Cbfal mRNA表达水*检测
3.6.1总RNA的质量鉴定
所提取的RNA电泳图呈现明显的三条带5s,18s和28s,说明RNA没有降 解(照片3.6)。
3.6.2

PCR产物表达水*检测

经PCR扩增后,各组均有目的基因条带,所获得的Cbfa 1和/3-actin产物大 小与预期一致,分别为171 bp和240bp(图3.4)。 空白对照组的目的基因表达均较其他组弱,10‘ug/mL杜仲叶提取物组其次, 其余各组相当,协同组与10’g/mL杜仲叶提取物组最亮,说明正常情况下,MSCs 会微弱的向成骨细胞分化,且分化过程中Cbfa 1参与了诱导过程,杜仲叶提取 物町以促进Cbfa 1基因表达的上调,并町能由此促进成骨细胞分化。 以目的片段Cbfa 1与内参照/3-actin扩增条带的吸光度比值来评定经诱导2 周后成骨细胞中Cbfa ImRNA表达水*,山表3可以看出,传统成骨诱导剂+杜 仲叶提取物组、10+、10。g/mL杜仲叶提取物组与传统成骨诱导剂组比较,尸> 0.05,无统计学意义;而与对照组比较,P<0.01,有显著统计学意义;10”g/mL 杜仲叶提取物组与对照组及其他各诱导剂组比较,P<O.05,有显著统计学意义 (表3.3,图3.5)。

第3章结粜

7Ibp

(bfal

r)c…t



囝3.4并实验组Cbfa lmRNA产物琼脂耱电泳照片

注:?中A.空白对照组.B.传统成目一诱导剂组,c.传统成目诱导荆+杜仲叫提取物组
(10

59/mL)。D.10"g/mL杜十p叶提取物组,E-lff59,札杜仲nl提取物组?F-1049/mL杜仲叶提
表3 3不同实验组C"ofa 1/口-acfin吸光度比值(X:ks,n=6)
Cbfa

取物纽所对应的电泳条带。

组别 空白对照组 传统诱导组 传统组+10 59/mL¥埘l-叫提取物组(10"5eCmL> 1042,mL杜仲叶提取物虮
10

1临actin吸光度比值
O 198±0021



38Ⅻ035

59mlAi._tq叶提取物组

0 373i0 029

10

6咖L杜仲叫提散物组

5 4 X 2 ●


囤图 网闲心闺



闲魁阏圈 网闷闲图 网闲 图

幽3.5小同实验组CbPa l/fl-actin啦光度比债的比较

第4章讨论

第4章讨论
4.1

MSCs的实验研究
MSCs是骨髓组织中除造血干细胞以外的一类干细胞,其形态与成纤维细胞

类似,因此又被称为成纤维细胞样克隆形成单位(Fibroblast

Colony.Forming units,

CFU—F),MSCs最早I妇Friedenstein等【28】分离获得,其在体内处于休眠状态,在体

外成贴壁生长,易于纯化、培养和扩增,在适当刺激下可进入细胞周期,具有 强大的自我复制能力和多向分化潜能,在一定条件下能够分化为多种组织细胞, 特别是中胚层和外胚层发育来源的组织细胞,如:成骨细胞、软骨细胞、心肌
细胞、血管内皮细胞等。
4.1.1

MSCs的分离培养
常用的分离MSCs的方法有直接贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞分离

仪分离法和免疫磁珠分离法等。直接贴壁法即根据MSCs具有较强的黏附贴壁 生长特性,定期换液、消化传代除去不贴壁细胞(血细胞、造血细胞等)和贴 壁较紧的纤维细胞;密度梯度离心法是根据骨髓中各种细胞成分比重的不同, 提取单核细胞层进行培养的方法;流式细胞分离仪分离法是以免疫荧光法使荧 光抗体与细胞膜表面抗原结合,继用超声波充分分散细胞制得单细胞悬液,通
过电场分离不同群的细胞。直接贴壁法操作简单,获得的MSCs活性和纯度均 较高,完全能满足试验需要。此外,流式细胞仪法、免疫磁珠法等免疫方法,

因MSCs本身缺乏特异性的表面标志物,分离提纯有一定难度,且费用较高,
尚未被广泛采用。

本实验采用直接贴壁法分离、纯化MSCs,应用含15%胎牛血清的DMEM
培养液进行培养,待贴壁细胞接*融合状态时,用0.25%胰蛋白酶(含

0.01%EDTA)短时问消化。经过换液、消化传代,使MSCs得到不断的纯化和
扩增,传至第3代时,MSCs纯化度在90%以上,细胞生长状况良好,具有较 为明显一致的生物学特性。
4.1.2

MSCs的生物学特性

骨髓州允质干细胞是上世纪70年代/j‘,I:始被认识到的‘一类成纤维集落生成

第4章讨论

细胞。1 968年Friendenstein等【28】首先通过体外培养发现从骨髓中能分离出具有

向多种间质细胞分化的祖细胞,当时称之为骨髓多能基质干细胞(marrow
pluripotent s仃omal stem

cells)。Owen等【29】通过对骨髓基质的研究,提出了骨髓

基质细胞学说,认为骨髓中存在着多能干细胞,在一定条件下能分化为纤维细 胞、网状细胞、脂肪细胞和成骨系列细胞,它们有共同的祖系,并且在一定条 件下可以相互转化,并将这种贴壁生长的骨髓单核细胞定义为骨髓基质干细胞
(bone mill'row stromal stem cell

BMSC)。骨髓间充质干细胞不仅具有干细胞的

特点,可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞,同时还能表达多种 基因,分泌多种成骨活性因子,为爬行替代、骨折愈合创造了有利条件,已在 体外研究及体内骨与软组织损伤修复方面显示出良好的应用前景,其主要的生 物学特性有增殖扩增能力和多向分化潜能。成人骨髓细胞(bone cells,BMCs)包括两种骨髓干细胞(bone
胞(hematopoietic stem
cells marrow stem cells

marrow

BMSCs):①造血干细

HSCs):可以发育成熟为各种血系细胞:②间充质

干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs):可以分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细

胞、成纤维细胞、骨髓基质和间充质细胞起源的其他组织分化的潜能。动物实 验证实【30】:全身或局部注入人胚胎骨髓间充质干细胞和自体骨髓间充质干细胞 很少发生移植排斥反应。同时,MSCs具有相当大的同种异体免疫调节能力,异 体的MSCs能被受体很好的耐受,是一种良好的替代治疗靶细胞。
4.1.3

MSCs的表面标志物
由于MSCs组成成分复杂,对其鉴定也相对复杂,至今还未发现MSCs特

异性的表面标记物,目前认为整合素家族成员CD29、黏附分子CD44、CDl66

以及CDl05等是MSCs的主要表面标志物【311,此外还有CDl3、CD54、CD90、 SH2、SH3和SH4等1321,但不表达造血细胞表面标志物CDl0、CD31、CD34、
CD38、CD45、CDlla、CDl4等p31。本实验将收集的第3代细胞采用流式细胞 术检测MSCs主要标志物CD29、CD44和CDl05阳性,说明表达间充质干细胞 标志物。
4.1.4

MSCs定向诱导成骨分化情况
多向分化潜能是MSCs最重要的生物学特性之一,体外培养的MSCs具备

极强的分化潜能和增殖能力,在体外不同的诱导条件下,MSCs可分化为不同的

第4章讨论

组织细胞,例如采用地塞米松,口.磷酸甘油和抗坏血酸等作为诱导因子,MSCs可 以分化为成骨细胞,形成聚集体或骨结节;在培养液中加入l一甲基一3一异丁基

黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛后,则细胞内含脂丰富的小泡逐渐增多,即 分化成脂肪细胞等,影响MSCs成骨分化的因素,简单的说可以归纳为化学、
生物、物理等主要因素,化学因素主要指常规传统诱导剂,如地塞米松、伊GP、 VitC等;生物因素指各种生长因子,如BMP2,转化生长因子母(TGF一零)等;

物理因素应用较少。



大量研究表明,中药能促进MSCs体外增殖,诱导MSCs体外高效的向成
骨细胞、成软骨细胞分化,这可能是中药治疗骨科疾病的关键机制。修忠标等【34】

研究证实鹿茸多肽(PAP)fl邑促进人MSCs的体外增殖,并发现10#g/mL PAP能获

得最佳促进MSCs增殖效应。刘玉瑜掣35】研究发现大黄素能促进MSCs向成骨
细胞方向分化,这一作用主要体现在骨形成过程的早期,对矿化期没用促进作 用。李楠等【36l应用体外培养的MSCs,在细胞和分子水*观察补骨合剂对细胞分

化的影响,以探讨治疗骨质疏松的机制。结果显示补骨合剂不仅可以增强基因 重组人BMP2(rhBMP2)的活性,促进分化中的MSCs表达TGF.届1,大量分泌I
型胶原,以利于钙盐沉积;还可以促进rhBMP2诱导的MSCs分泌碱性磷酸酶 (ALP)和骨钙素,促进MSCs向成骨细胞表型分化,从而促进钙磷在骨表面沉

积。许春姣等【3‘7】研究显示在MSCs诱导培养的早期,加入低浓度黄芪注射液,
有利于促进MSCs增殖和分化成骨,而长期高浓度则明显降低MSCs分化功能。 王和鸣等138l通过实验证实:巴戟天(包括水提物、醇提物)能诱导MSCs向成骨细 胞分化,在经典成骨诱导组中使用巴戟天水提物、醇提物含药血清培养能显著 促进MSCs向成骨细胞分化。吴云刚等【39】发现:将右归饮含药血清加入人MSCs 诱导分化成骨细胞的培养体系中,其对成骨细胞的增殖能起到促进作用,* 节染色及细胞内ALP含量测定表明右归饮对成骨细胞的活性有促进作用。 MSCs体外诱导成骨分化的过程足一个细胞转化的过程,即各种诱导剂作用 下由MSCs向成骨细胞转化,这个过程中,可能会有一个少量细胞由贴壁到漂 浮死亡适应诱导剂的过程,我们在试验过程中使用10’Jg/mL浓度的杜仲叶提取 物时有部分细胞漂浮死亡,而10-斗g/mL及以上杜仲叶提取物诱导时细胞未见明 显死亡。诱导后MSCs丌始转化,由单。‘的纤维状的MSCs逐渐向成骨细胞分 化,变成立方形和多角形形态,随着培养时fUJ的延长,细胞大量增殖,进入,£ 长增殖期,随着细胞数量的增多,J1:始呈多层重叠生长,细胞之I、日J界限模糊,
19

第4章讨论

并分泌胶原纤维、ALP,逐渐形成了多个散在的细胞结节,钙沉积逐渐出现,最 终形成钙化结节,完成骨形成的过程。在细胞转化成熟的过程中,ALP为骨形 成所必需的酶,在体外钙化中起着关键性的作用,其主要作用为水解有机磷酸, 使局部P04P浓度升高,结合并转运钙,启动钙化,降解微环境中的钙化抑制剂, 是成骨细胞分化的早期标志【401,表明由MSCs转化的成骨细胞己经逐渐成熟, 并预示着进一步钙化的发生,此时ALP的分泌达到最高值,此后成骨细胞继续 分化为成熟细胞进入矿化期,细胞内的ALP活性下降,因此通过测量细胞内ALP 的活性可反映MSCs分化成熟的程度。体外成骨的测定方法很多,Von Kossa法 矿化结节染色是广为应用的一种确定细胞外基质矿化的方法,磷酸钙盐矿化结 节阳性反应呈黑色。 本实验选用成骨细胞早期分化的标志蛋白ALP和晚期分化的指标*峤谧
为检测指标。ALP活性结果显示传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组、lO’、10。Jg/mE

杜仲叶提取物组诱导情况优于传统成骨诱导剂组、10”g/mL杜仲叶提取物组及空 白对照组,P<O.05,有显著统计学意义;10-'*、10。Jg/mL杜仲叶提取物组相比较,
P>0.05,无统计学意义。矿化结节染色结果表示,传统成骨诱导剂+杜仲叶提取

物组、10叶、10。Jg/mL杜仲叶提取物组矿化结节直径大、染色深、数量多,而空
白对照组未见明显矿化结节形成,与空白对照组、传统成骨诱导剂组及10…g/mL

杜仲叶提取物组比较,P<0.05,有显著统计学意义,10-'*、10。g/mE杜仲叶提取 物组相比较,P>0.05,无统计学意义。说明10’、10。Jg/mL杜仲叶提取物成骨 诱导效果*似,优于传统成骨诱导剂,10。”g/mL杜仲叶提取物诱导能力不足,
可能为浓度过低所致。
4.1.5

MSCs定向诱导成脂肪分化情况

采用传统成脂诱导剂及不同浓度的杜仲叶提取物作为诱导剂进行成脂肪诱 导,在传统成脂诱导培养体系中,Dex可激活MSCs表面的糖皮质激素受体,使 其向脂肪细胞分化,胰岛素与IGF一1受体结合,通过激活AKt、Ras、ERKl/ERK2

等信号传导途径以及降低核蛋白磷酸酶PP2A的活性柬凋节CAMP反应元件结
合蚩12I(CREB)的磷酸化和转录活性,从而使MSCs向脂肪细胞分化,而Lee等Iz2J

研究发现,杜仲叶提取物具有抑制骨髓fHJ充质于细胞向脂肪细胞分化的作用,
这是其防治骨质疏松的主要机制之一。 本实验采用油红0染色观察MSCs经诱导后转化为脂肪细胞的数目,结果

20

第4章讨论

表明传统成脂诱导剂诱导后的MsCs由原来的梭形变为圆形或多角形,胞内有脂

滴出现并逐渐聚集成大脂泡,细胞核被脂滴挤于一侧,表现出与脂肪细胞相似的 生长特点,而且细胞间质也可见散在脂肪滴,细胞内脂肪含量明显增加,油红O 染色阳性。染色前光镜下大体观察空白对照组与传统成脂诱导剂组可见折光性

脂滴,表明自然接种的MSCs具有一定的成脂肪分化能力,1旷、10。g/mL杜仲
叶提取物组未见明显脂滴,说明该浓度杜仲叶提取物具有明显抑制MSCs向脂 肪细胞分化的能力,’而10”g/mL杜仲叶提取物组可见散在的小脂滴,但较空白 对照组少,说明该浓度杜仲叶提取物具有一定的抑制MSCs向脂肪细胞分化的 能力,但较10_’、10。g/mL杜仲叶提取物抑制效力弱;油红O染色后观察,传 统成脂诱导剂组大量细胞的胞浆内有脂滴出现,脂滴体积大而密集,可见大量 脂肪小球,偶可见脂肪空泡,细胞间质也可见散在脂肪滴;传统成脂诱导剂+杜 仲叶提取物组细胞胞浆内及细胞外的脂滴情况相当,为小脂滴,偶见脂肪小球, 与空白对照组相当,但数量明显少于传统成脂诱导剂组;1019/mL杜仲叶提取 物组次之;10-'+、10。g/mL杜仲叶提取物组仅有部分细胞的胞浆内出现脂滴,脂 滴体积小且散在分布。实验结果表明,以104、10。g/mL浓度的杜仲叶提取物抑 制MSCs向脂肪细胞分化效果最佳,10…g/mL杜仲叶提取物抑制能力不足,可
能为其浓度过低所致。

4.2杜仲叶提取物的成分及药用价值
杜仲(Eucommia
ulmoides

oliv)系杜仲科杜仲属植物,是仅存于我国的第3

纪孑遗植物,杜仲作为中药在国内已有2000年的药用历史,主要以杜仲皮入药, 具有补肾,强筋健骨之功效,杜仲的主要功效成分有木脂素类、环烯醚萜类、 苯丙素类、黄酮类、多糖类、杜仲扩真菌蛋白,此外杜仲还含有丰富的营养成

分有氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素等,杜仲叶醇提取物主要含有绿原酸、
多酚、黄酮类等成分,具有提高骨密度、抑制骨吸收的作用。杜仲叶含有与杜 仲皮相似的化学成分,药效作用办相同,可代皮供药用,解决杜仲资源匮乏的 词题。 绿原酸结构式如下:

投拍
2l



第4章讨论

现代药理研究表明,杜仲在治疗骨坏死性疾病方面有其独特疗效:①提高 成骨细胞的活性,促进骨细胞的分化和增殖。②促进毛细血管再生,改善局部 微循环。③抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化,防治骨质疏松。④补充骨 折所需要的微量元素,加速骨痂的改建等。本实验采用不同浓度的杜仲叶提取
物诱导MSCs,证实其具有促进成MSCs成骨分化及抑制成脂肪分化的功效,实

验结果表明,以10_’、10。g/mL杜仲叶提取物效果最佳,与文献报告一致。

4.3

MSCs向成骨细胞分化的基因调控机制

4.3.1核心结合因子a 1(Cbfa 1)
1997年Dutyt4l】等克隆了成骨细胞特异性转录因子/核心结合因子a 1(ostcoblast—specific
transcription factor/core binding factor-a 1,Osf2/Cbfa

1),证实

其仅在骨组织和成骨细胞表达。Cbfa l又称为多瘤病毒增强子结合蛋白
2aA(polymavirus enhancer
binding protein 2aA,pebp

2aA)或急性骨髓性白血病因

子3(acute myeloid leukaemia3 AML3),属于runt结构域基因家族的转录因子,其 家族包括以下3个成员:Cbfal/Pebp 2aA/AML3、Cbfa2/pebp 2aB/AMLl和
Cbfal/pebp

2aC/AML2,它们的共同特点是在其分子结构中均含有一个氨基酸组

成DNA结合区,该结合区由128个氨基酸组成并与果蝇属的pai.rule基因runt

同源,因此也属于runt结构域蛋白家族【421。人类的Cbfal基因定位于6p21,最
早克隆的Cbfal基因为7个外显子,编码513个氨基酸的蛋白【4引,后来Mundlos 等【44】发现在其第1外显子上游还有不同N端的两个外显子,所以目前认为Cbfal 包括从9个外显子(一l-7),不同的种类和部位,可以产生不同的转录本。Cbfal 基因有3个异形体,虽然它们5’端的序列不同,但3’端相同,且都含有runt结

构域,表明它们来自同一个基因1451。最初发现的cbfal编码由MRIPVA氨基酸序
列丌始的513个氨基酸组成的蛋白质,它的基因只在脾、胸腺和一些T细胞等 少数组织和细胞中存在14引。N端由MASNSL氨基酸序列丌始的cbfal异形体在 T47i淋巴瘤细胞、成骨细胞和骨肉瘤细胞巾有表达【4 71。第三个cbfal异形体 --cbfaI/Osf2,它的N木端由MLHSPH构成,其仅在骨组织和成骨细胞中有表 达,在其它组织中未见表达14引。

Cbfal具有一个与DNA结合的runt结构域和被认为具有转录活性的羧基端
富含脯、丝、苏氨酸的PST结构域14…。与其它runt结构域蛋白成员比较,CbfaI/Osf2

第4章讨论

尚有一些不同的氨基酸结构域【501。Kundu等【5l】认为cbfaI/Osf2氨基酸序列中存 在三个转录激活区和一个抑制区,即ADl(activation domain)由19个氨基酸残基 组成,构成CbfaI/Osf2的第一个转录激活区;AD2由29个谷氨酸残基和18个 丙氨酸残基(QA区)组成,位于runt结构域的N端,具有阻止全长CbfaI/Osf2 与Cbfb形成异源二聚体的作用,是CbfaI/Osf2的第二个转录激活区;AD3位于 PST结构域的N端,由27个氨基酸残基组成,构成CbfaI/Osf2的第三个转录激 活区;转录抑制区是由位于PST结构域的C端的154个氨基酸残基组成。另外, CbfaI/Osf2氨基酸序列的C端终末5个氨基酸对于CbfaI/Osf2的转录活性也具 有抑制作用。
4.3.2
Cbfa

1与成骨细胞分化

骨骼的发育包括骨骼始基形成、相应间充质干细胞向成骨细胞系和成软骨 细胞系演变、造血干细胞向破骨细胞系分化,以及这些前体细胞向软骨细胞、
成骨细胞和破骨细胞的终术分化。间充质干细胞是多能性的,在特定转录因子 的诱导下可向不同的方向分化,如在肌特异性转录因子MyoD的作用下间充质 细胞分化为肌细胞系,而在过氧化物酶体增殖物激活受体位(PPAR'y2)的作用下

则分化为脂肪细胞系f5厶”】。因此,人们一直推测在间充质干细胞向成骨细胞系
的分化过程中存在一种骨特异性的转录因子来决定这一分化过程,Komori等【55】 己证实,这种转录因子即是Cbfal。Banerjee等【561应用原代成骨细胞也证实Cbfal 反义寡核昔酸抑制体外成骨细胞分化及骨形成,提示在成骨细胞分化中Cbfal的

重要作用,Ducy掣4l】利用原位杂交等方法证实,CbfaI/Osf2仅在骨组织和成骨
细胞中检测到,其试验过程表明,小鼠受精后10.5d胚胎发育阶段,可见 CbfalmRNA在胚胎问充质细胞凝聚区的表达,而骨骼的初期钙化发生在受精后

14.5d,Cbfal表达的时问较骨钙素早,在受精后16d胚胎的领面骨、颅骨、胸骨
和舌骨可见Cbfal的高表达,由于Cbfal的表峰值与鼠胚胎骨骼发育的问质细胞 凝聚时间吻合,而且在凝聚的间充质细胞既有Cbfal转录信号,又有II型胶原信 号表达,所以骨骼发育早期的间充质细胞具有向成骨细胞系和成软骨细胞系分 化的能力,无沦是膜内成骨还是软骨内成骨,Cbfai都可能调控着成骨细胞发育

过干足中的多种旗I捌表达。Komori等155’及Otto等例利用cbfal基冈缺失或突变的
小鼠,对cbfal在胚胎骨骼的发育过程的作用进行了研究,发现突变的纯合予鼠 丧失了成骨细胞分化功能和骨髓造血功能,缺乏骨组织和骨髓形成,出乍时死

23

第4章讨论

于呼吸困难:Ducy等【43】利用在出生后分化的成骨细胞中过度表达cbfal的转基 因小鼠,证明Cbfal除调节成骨细胞分化外,还调节已分化成骨细胞的功能和其

它骨细胞外基质蛋I刍(extracellular

matrix protein,ECMP)的基因表达,从而控制

出生后骨骼形成和发育的生理过程,

ECMP对骨骼的形成十分重要,而骨钙素

是其中含量最丰富的一种,也是迄今被证明的唯一的只由成骨细胞产生的

ECMP,并被认为是成骨细胞分化和成熟的标志【58】,其在研究对骨钙素基因结构 及转录调控中发现,在小鼠和大鼠骨钙素基因的启动子区有一个成骨细胞特异性
的反应元件OSE2(osteoblast.specific cis—acting element),而且证明该反应元件含

有与Cbfal的runt结构域特异性结合的核心位点。Cbfal通过调节这些基因在成 骨细胞的表达,来促进成骨细胞的分化和成熟。Tsuji等【59】发现在生长发育期鼠 的颅骨组织和成年鼠骨骼干骺端和骨骺等,可检测到Cbfal的表达,而在缺乏新 骨形成的成年鼠颅骨则无表达,因此表明Cbfal的表达影响着新骨形成中成骨细
胞的功能。

Cbfal作为成骨分化的关键性转录因子,它能在非成骨细胞或成骨前体细胞 上调成骨细胞标志基因(marker gene)的表达。Redan等嘲lDucy等【6l】结果证实在 鼠颅骨来源的非分化细胞MC3T3E.1,瞬时转染Cbfal能明显上调骨钙素、OPN 和I型胶原等表达,在C3H10TI/2成纤维细胞及皮肤成纤维细胞也有类似的结 果。Ji等f62】的实验显示Cbfal突变体导致间充质干细胞3T3一F442A成骨抑制,提
示Cbfal是MSCs最终成骨分化的重要转录因子。Piccolo等163】在研究BMP一2和 BMP一7对C3H10T1/2的促成骨分化过程中,发现在成骨细胞特异性基因表达前,

首先表达Cbfal,表明cbfal在BMP诱导成骨分化中的级联效应中发挥了信号作
用。王敏等畔】在研究犬骨髓基质干细胞诱导分化实验认为,干细胞向成骨细胞

分化的过程中,首先出现Cbfal的表达,启动细胞分化的“丌关”,从而促进成骨
细胞特异性标志蛋白的表达。 本实验采用RT.PCR的方法分别检测了普通培养条件下即空自组和不同诱 导条件下的细胞内Cbfa lmRNA的表达情况。结果显示诱导14天后,各组均具 有该基冈的表达,空白组的Cbfa lmRNA的少量的表达,I’日J接表示自然接种的

MSCs有一定的成骨分化能力,10-'*、10。g/mL杜仲叶提墩物组Cbfa l表达水*
明垃高丁空白埘照组,与传统成骨诱导组及传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组*

似,说明。一定浓度的杜仲叶提取物(10-'*、10。Jg/mL)与传统诱导荆一样具有明
显的成骨诱导能力,能够诱导MSCs向成骨细胞分化,但低浓度(1019/mL)
24

第4章讨论

的杜仲叶提取物虽然具有一定的成骨诱导能力,但较lO’、10。g/mL杜仲叶提

取物及传统成骨诱导剂效果差。实验结果表明,杜仲叶提取物通过促进细胞高
效表达Cbfa l,从而促进MSCs向成骨细胞分化,大量分泌ALP和形成*峤凇

总之,与空白对照组比较,各成骨诱导剂组细胞内碱性磷酸酶合成增多, 形成矿化结节,且传统成骨诱导剂+杜仲叶提取物组、lO叶、10叼g/mL杜仲叶提
取物组诱导成骨情况优于传统成骨诱导剂组、10叼g/mL杜仲叶提取物组;RT—PCR

显示各成骨诱导剂组均能高效扩增出171 bp的Cbfal基因转录片段,以10-'*、 10。g/mL杜仲叶提取物效果最佳;与空白对照组及传统成脂诱导剂组比较,不 同浓度的杜仲叶提取物组经油红O染色显示脂肪细胞数明显下降。通过本实验 证明杜仲叶提取物不但具有促进MSCs成骨分化的作用,而且还具有抑制MSCs
成脂肪分化的双重调节作用。

25

第5章结论

第5章结论
本课题主要运用体外细胞培养技术,观察具有补肾、强筋健骨作用的杜仲 叶提取物对羊MSCs进行体外干预,观察其对羊MSCs成骨分化和成脂肪分化 的影响;观察培养体系诱导过程中相关信号分子Cbfal基因表达情况,探讨杜仲 叶提取物作用的可能机制。从本实验得到如下结论: 1.采用全骨髓(贴壁)培养法可稳定获得均质性良好的羊MSCs。
2.10q、10~、10’og/mL杜仲叶提取物能够促进体外培养条件下羊MSCs

增殖,能够促进体外培养条件下羊MSCs的成骨分化,并能增加反映成骨细胞 功能的ALP活性和矿化结节数目,而且以lO一、10叼g/mL浓度的杜仲叶提取物 成骨效果最佳。 3.10叶、10~、10叼g/mL杜仲叶提取物能够抑制羊MSCs向脂肪细胞分化,
明显减少脂肪细胞数,而且以10~、10叼g/mL浓度的杜仲叶提取物抑制成脂肪分

化效果最佳。
4.10叶、10。g/mL杜仲叶提取物可以上调成骨诱导MSCs的Cbfal mRNA的 表达,提示杜仲叶提取物诱导羊MSCs成骨分化的可能作用机制。

本实验证明杜仲叶提取物不但具有促进MSCs成骨分化的作用,而且还具有 抑制MSCs成脂肪分化的双重调节作用,杜仲叶提取物的浓度以lO叶、10-)g/mL
效果最佳。

致谢

致谢
岁月如歌,光阴似箭,三年的研究生生活即将结束。回首三年的求学历程, 对那些引导我、帮助我、激励我的人,我心中充满了感激。 首先要特别感谢我的导师罗军教授。导师学识渊博,在课题设计、临床工 作以及生活学*等方面给予我悉心指导和耐心帮助;导师宽广的胸襟、严谨的 治学态度和一丝不苟、精益求精的工作作风永远是我学*的榜样,让我终生受 益,在此表示我最诚挚的谢意! 在临床实*过程中,我尊敬的殷明主任医师、顾玉荣副主任医师、矢庆明 主治医师等指导小组成员,给以了我极大的指导和帮助,为我今后的临床工作
打下了坚实的基础,在此表示衷心的感谢!

感谢戴江华博士在实验中所给以的巨大帮助!感谢我的同学彭曼、万俊明、 周建敏、蔡成行、吕世刚、黄玲等在试验、工作及学*中的帮助!感谢所有关
心和帮助过我的老师和同学!

感谢南昌大学第二附属医院分子中心各位老师的帮助,使我的实验得以顺利
完成! 三年学*期间,研究生处、二附院*炭频母魑涣斓肌⒗鲜Ω枇巳惹榈 帮助,在此表示感谢! 最后,特别感谢我的妻子、儿子、我的父母和姐妹的关心和理解,正是他 们所给予的精神上和物质上的巨大支持,才使我得以顺利完成学业! 再次向所有关心、支持和帮助过我的老师、同学、朋友和亲人们致以最诚 挚的敬意和衷心的感谢!

陈伟才 2009年5月

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31

附录^实验照片

附录A实验照片

鬻懑
羊MSCs生长状况(A~Dxl00)

照片3.2羊MSCs成骨诱导14天后ALP染色结果(A~n100)

隧茎!堡些竖苎


照片3.3羊MSCs成骨诱导14灭后*幔杖旧峁ǎ痢啤粒玻担埃





照片3.4芊MSCs成脂肪诱导2l犬后,油红0染色前光镜F所见脂滴(A~Fxl00)

附求^实验照片

j!}}片3.6成骨诱导后MSCs总RNA电泳结果

附录B综述

附录B综述
中药结合骨髓间充质干细胞移植治疗股骨头坏死的研究进展
陈伟才综述 摘要:股骨头坏死(osteonecrosis
罗军审校 head,ONFH)是一种进展性和

ofthe femoral

致残性疾病,保存自身股骨头是临床治疗所追求的目标,但是到目前为止还没

有一种治疗方法能达到理想的治疗效果。研究发现骨髓间充质干细胞
(mesenchymal stem cells,MSCs)具有的强大增殖扩增能力和多向分化潜能的生物 学特性,并且中药在MSCs的扩增、定向分化的调控等方面都有其独特的作用。 本文就目前中药结合MSCs移植治疗ONFH的研究进展进行了综述。

关键词:中药;骨髓间充质干细胞(MSCs);移植;股骨头坏死(ONFH)
股骨头坏死(osteonecrosis
of the femoral head

ONFH)是骨科常见病、多发

病,是一种进展性和致残性疾病,主要发生在30—50岁的中青年,约有半数累 及双侧股骨头,是对髋关节具有特殊破坏性的退行性病变,最终导致髋关节功

能*现赜跋旎颊呱钪柿浚斐沙林氐募彝ズ蜕缁岣旱!F浞⒉』频
学说有很多,但目前尚未完全阐明,因此治疗比较困难。虽然ONFH的治疗方 法很多,但尚没有一种适应症合理、疗效确切的方法。因此,探索新型、有效、 微创的治疗方法是今后的趋势,随着*年来MSCs研究的逐渐深入,结合组织 工程材料、成骨诱导因子、中药等对ONFH的研究所取得重大进展,充分发挥 中西医结合的独特优势,将中药联合MSCs来治疗ONFH,探讨其基础理论, 为今后该项技术应用于临床打下J簪实的基础,现就目盼中药结合MSCs移植治 疗ONFH的研究进展综述如下。



ONFH的病因和发病机制
ONFH又称股骨头无菌性坏死或股骨头缺血性坏死,是骨坏死的一种,是

由于多种病l奎l破坏股骨头的丸供,使骨的活性成分(包括骨细胞、骨髓细胞和 脂肪细胞)死I’:所引起的…个病理过程,最终导致整个髋关节功能比失。供应 成人的股骨又和股骨颈的主要动脉是旋股内侧动脉和旋股外侧动脉发卅的分支

附录B综述

所形成的支持带动脉,骨坏死是多种原因导致的股骨头支持带血管损伤,骨基 质的缺血变性而坏死,进一步发展致股骨头塌陷和囊性变,继发关节软骨退行

性变、骨赘形成、骨性关节炎而致俄关节功能丧失,若治疗不及时,最终可导 致残疾。缺血性ONFH可以分为两类:(1)创伤性ONFH,为骨坏死的常见病因。 经颈股骨颈骨折、创伤性髋关节脱位、股骨头骨折均可引起ONFH;(2)非创伤性 的ONFH,主要见于长期服用糖皮质激素、酒精、减压病、*系统疾病、病
毒感染等。


ONFH的发病机制一直是学术界争论的焦点,创伤性ONFH是由于股骨头血 运的直接阻断所致,而非创伤性ONFH的发病机制研究目前仍不十分清楚,主要 有脂肪栓塞学说、骨细胞脂肪变性坏死学说、骨内高压及静脉淤滞学说、骨质 疏松学说、微血管损伤学说、
血管内凝血学说及激素的细胞毒性学说等假说,

一般认为与骨细胞及血管因素直接相关。长期类固醇治疗及酗酒可引起高脂血 症及脂肪肝,骨内超负荷脂肪栓塞伴脂肪清除力降低及血管凝血是可能的发病 机制。*年来有关*高凝状态、血栓形成体质及纤溶能力下降、凝血异常导 致的髓内血管内凝血学说倍受关注。总之,不论何种原因,其共同的致病机理 均为股骨头血流量逐渐下降引起骨髓组织缺氧,继而组织水肿,迸一步使骨髓 内高压,形成恶性循环,从而导致骨缺血坏死的发生。

2中医对ONFH的认识与研究现状
ONFH是现代医学的疾病名称,中医并无此名,但中医典籍早有类似记载。
就其发病部位、病因病机及证候特征而言,一般认为当属“骨痹”、“骨痿”、“骨

蚀”、“髋骨痹”、“历节风”等范畴。邓沂等川则认为“骨痹”、“骨痿”、“骨蚀”是ONFH
的不同发展阶段、不同病理改变、不同证侯表现的相应病名,即早期以瘀血、 气血闭阻为基本病机,称之为“髋骨痹”、“骨痹”;晚期有股骨头塌陷、缺损,

称之为“胃’蚀”:而早期与晚期之问有髓减骨桔,筋骨痿软,则称之为“骨痿”,较
符合临床实际,更具有中医约特色。一般认为,ONFH的内因有先天不足、肝肾 亏虚、气血不足;外因行邪毒、外伤、湿热等侵犯经络,导致气血痹阻、髓海

瘀滞、髓死骨枯,但其病机以气滞血瘀、筋脉阻滞最为关键。 随着现代医学的不断发展,越来越多的学者将中医药结合现代医学进行研
究,以期找到治疗ONFH的有效方法。李峻辉等12I认为活血化瘀中药及血管内皮

附录B综述

生长因子(vEGF)基因转移均可促进股骨头缺血坏死处局部新生血管形成和侧 支循环的建立,尤以活血化瘀中药联合基因疗法效果为好。动物实验发现,中

药、基因各组较模型组血管数目均有增加,其中基因组的血管数目明显多于模 型组。“等13i指出古复生胶囊通过增加纤溶酶原激活剂和NO的水*机制治疗激
素性股骨头坏死(Steroid.induced avascular necrosis
of the femoral

head,Sm盯H)。

Chen等14I指出承载丸能够使SANFH骨细胞脂肪小滴减少,微循环得到改善,骨 矿密度增加,骨质量、骨强度不同程度增加,雌激素的低水*状态也得到改善。 史风雷等IsI通过研究认为活血化瘀类中药防治ONFH的机理是不仅改善了股骨
头的微循环,而且抑制了骨髓基质细胞的成脂分化,增加了成骨细胞的表达。

现代药理学研究发现活血化瘀中药具有以下作用:
降低*黏滞性; 附、聚集和释放;

(1)改善微循环*

(2)

(3)扩张外周血管、增加器官学流量;

(4)抑制血小板黏

(5)降血脂,增强细胞对缺氧的耐受力,提高超氧化物歧化

酶的活性,减轻组织对缺氧再灌注损伤的作用。



MSCs的生物学特性
MSCs是上世纪70年代才开始被认识到的一类成纤维集落生成细胞。1968年

Friendenstein等16J首先通过体外培养发现从骨髓中能分离出具有向多种间质细胞 分化的祖细胞,当时称之为骨髓多能基质干细胞(bone marrow
stem
plufipotent stromal

cells)。Owen等17I通过对骨髓基质的研究,提出了骨髓基质细胞学说,认

为骨髓中存在着多能干细胞,在一定条件下能分化为纤维细胞、网状细胞、脂 肪细胞和成骨系列细胞,它们有共同的祖系,并且在一定条件下可以相互转化, 并将这种贴壁生长的骨髓单核细胞定义为骨髓基质干细胞(bone marrow
stem stromal

cell,BMSC)。MSCs不仅具有干细胞的特点,可分化为成骨细胞、软骨细

胞、脂肪细胞和成肌细胞,同时还能表达多种基因,分泌多种成骨活性凼子, 为爬行替代、骨折愈合创造了有利条件,已在体外研究及体内骨与软组织损伤 修复方面显示出良好的应用前景。成人骨髓细胞(bone 括两种骨髓-T..细胞(bone
(hematopoietic stem cells marrow stem cells marrow

cells,BMCs)包

BMSCs):(1)造血干细胞 (2)问充

HSCs):可以发育成熟为各种血系细胞;

质千细胞(mesenchymal

stem

cells,MSCs):可以分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪

细胞、成纤维细胞、骨髓基质和间充质细胞起源的其他组织分化的潜能。动物

37

附录B综述

实验证实18I:全身或局部注入人胚胎MSCs矛II自体MSCs很少发生移植排斥反应。
同时,MSCs具有相当大的同种异体免疫调节能力,异体的MSCs胄P.被受体很好

的耐受,是一种良好的替代治疗靶细胞。 骨髓中只含有少量的MSCs,在新鲜骨髓中MSCs占有核骨髓细胞的0.0001 %~O.01%19,10l,并随年龄的增加而减少。体外单层培养的MSCs夕b形类似成纤维 细胞,呈长梭形,体积较大。原代细胞接种贴壁后,经过2"--4天的潜伏期开始 迅速地克隆性扩增,类似旋涡状盘旋排布,10~14天可接*融合’,经传代的细 胞形态更一致,对数增长期细胞倍增时I、日J为33~38小时。其主要的生物学特性 有:(1)增殖扩增能力。Colter等111I报道极低密度培养能保持MSCs的增殖能力,
20

mL的骨髓样本经3代6周的培养可扩增2x109倍,达lO”个细胞,相当于成年

人体细胞总数。(2)多向分化潜能,是最重要的生物学特性。例如采用地塞米松,伊 磷酸甘油和抗坏血酸等作为诱导因子,MSCs可以分化为骨细胞,形成聚集体或骨 结节112I;在DMEM.HG培养液中加入地塞米松、胰岛素、TGF一角等可诱导MSCs
分化成软骨细胞I”1;在培养液中加入1一甲基一3一异丁基黄嘌呤、地塞米松、 胰岛素、吲哚美辛后,则细胞内含脂丰富的小泡逐渐增多,即分化成脂肪细胞Il
4I

等。MSCs来源于中胚层,是外胚胎发育早期阶段的细胞成分,人体中,由中胚
层生发而来的组织器官很多,如骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、真皮等组织。

MSCs与这些组织有起源上的相关性,具有分化出这些组织的潜能。在适宜的体 内或体外环境下,MSCs不仅可以分化为间充质组织,还可以分化为神经系统、
肝脏、肺、上皮组织等。正是由于MSCs具有以上生物学特性,奠定了临床应用 的略实基础。



MSCs移植治疗oNFH的研究现状
*年来MSCs的研究不断深入,结合组织工程材料、成骨诱导因子(On骨形态

发生蛋白、转化生长因子口)等对ONFH的研究取得很人进展。Yan等IlSl在髓芯减
压的基础上.经减压通道置入一根硬膜外导管,将自体MSCs注入,能在改善骨内高 压、骨微循环*炔±碜刺摹阂唬适保峁┕晒且逍薷粗亟ǖ闹肿酉赴鹿巧 成、替代死骨创造良好的环境。章建华等Il 6I采用髓芯减Ji;)JH自体多能干细胞、 脱钙骨基质植入治疗早期ONFH,报告52例61髋,随访超过2年,其中46髋疼痛消失,

活动fI如,10髋病情缓解,总优良率达91.8%。季卫锋等Il¨心用MSCs动脉灌注治疗

附录B综述

ONFH,实验结果提示MSCs组显效的时I’日J更快捷、更容易诱导再骨化过程,其 认为MSCs在分化为成骨细胞的过程中合成分泌的成骨诱导因子起关键作用。杨 晓凤等118I采用超选择性股骨头供血动脉干细胞移植术的方法治疗ONFH患者63 例,所有患者髋关节疼痛均有不同程度的缓解,其中5例患者干细胞移植后6个 月数字减影血管造影术血管造影,发现不仅股骨头区有大量新生血管,原已闭 塞的动脉也重新开通,血流速度增快,局部*循环明显改善.2例18个月X射线 摄片、CT扫描显示股骨头坏死区缩小,可见新骨形成。孙伟等1191研究认为MSCs 有较强的成骨作用,可促进ONFH骨缺损的修复,对ONFH治疗有较大价值,并采用 纳米晶胶原基骨(nano.hydroxyapatite collagen,nHAC)和MSCs复合材料修复兔 ONFH骨缺损12们,结果认为, nHAC具有较强的传导成骨作用,是修复兔股骨头

骨缺损的良好移植材料,复合MSCs后能促进骨缺损的修复,对ONFH的治疗有较 大价值。徐晓良等12lJ在动物模型中应用“BMP/胶原/珊瑚”组织工程化骨治疗 ONFH,结果发现组织工程化骨具有较强骨诱导及骨传导作用,可作为修复 ONFH的好材料。汤亭亭等122l利用干细胞移植和骨形态发生蛋白.2(BMP2)基 因治疗修复骨损伤和骨坏死的实验研究认为BMP2基因转染的自体MSCs可诱导 植入的MSCs和周围长入的MSCs向成骨细胞分化,启动骨再生和修复。Yang等Iz3I 采用分子生物学的新方法,应用血管生成因子基因治疗ONFH,经动物实验证明, 2~4周后可见明显血管生成,6"--8周后可见明显骨形成。因此,MSCs移植治疗 ONFH有其独特的优势,能诱导新骨形成、修复骨缺损、防止股骨头进一步塌陷。



中药结合MSCs移植治疗ONFH的研究进展
现代医学的飞速发展,为中国传统中医药结合现代医学科学技术治疗ONFH

提供了契机。大量研究结果表明,中药能促进MSCs体外增殖、诱导MSCs体外

高效的向成骨细胞、成软骨细胞分化,这可能是中药治疗骨科疾病的关键机制。
修忠标等124I经研究证实鹿茸多肽(PAP)能促进人MSCs的体外增殖,并发现 10#g/mL时PAPh'皂获得最佳促进MSCs增殖效J逦。刘玉瑜等|2sI研究发现大黄素能 促进MSCs向成骨细胞方向分化,这一作用辛要体现在骨形成过程的早期,对矿 化期没用促进作用。李楠等Iz6I应用体外培养的MSCs,在细胞和分子水*观察补 骨合剂对细胞分化的影响,以探讨治疗骨质疏松的机制。结果显示补骨合剂不 仅可以增强基因。囊组人BMP2(rhBMP2)的活性,促进分化巾的MSCs表达转化

39

附录B综述

生长因子pl(TGF—p1),大量分泌I型胶原,以利于钙盐沉积;还可以促进rhBMP2 诱导的MSCs分泌碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素,促进MSCs向成骨细胞表型分

化,从而促进钙磷在骨表面沉积。许春姣等127l研究显示在MSCs诱导培养的早期, 加入低浓度黄芪注射液,有利于促进MSCs增殖和分化成骨,而长期高浓度则明 显降低MSCs分化功能。王和鸣等1281通过实验证实:巴戟天(包括水提物、醇提 物)能诱导MSCs向成骨细胞分化,在经典成骨诱导组(地塞米松、维生素C和伊 甘油磷酸钠)中使用巴戟天水提物、醇提物含药血清培养能显著地促进MSCs向成 骨细胞分化。吴云刚等1291发现:将右归饮含药血清加入人MSCs诱导分化成骨 细胞的培养体系中,其对成骨细胞的增殖能起到促进作用,*峤谌旧跋赴 内ALP含量测定表明右归饮对成骨细胞的活性有促进作用。肖鲁伟等f30l通过观 察右归饮含药血清对兔MSCs体外培养的增殖及向软骨细胞诱导分化的影响。发
现经右归饮含药血清诱导后,经HE染色,见细胞形态由原先的长梭形、纺锤形

逐渐变为圆形、椭圆形,II型胶原免疫组化染色显示呈现阳性,可见棕黄色的 颗粒分布于细胞胞浆内,从而说明右归饮也可以有效地诱导MSCs定向软骨细胞
分化。韩国学者Lee GW等【3Il研究发现,杜仲提取液具有抑制MSCs向脂肪细胞

的分化作用。 至于从分子水*方面的研究,目前对SANFH的研究较为深入。糖皮质激素 既可通过抑制骨形态发生蛋白(BMP)和核心结合因子al(Cbfa 1)以及调节细 胞周期柬影响成骨细胞增殖和分化13玉33l,促进MSCs分化为脂肪细胞,抑制其分 化为成骨细胞,又可通过对破骨细胞的活化作用导致骨的溶解吸收,从而使得 骨组织强度下降,发生应力性股骨头塌陷。目前,已经发现很多对破骨细胞的
功能起调节作用的细胞因子,而骨保护蛋白(OPG),NF—KB受体活化因子 (RANK),NF.KB受体活化因予配体(R ANKL)组成的OPG/RANK/RANKL

信号转导系统对_丁.破7骨’细胞的成熟、分化及功能发挥起重要的作用13训,糖皮质

激素通过下调OPGmRNA的表达,提高RANK和RANKL的结合水*,从而增加
破骨细胞的生成和活性,造成大量的骨质破坏;SANFH另一条调控途径是Cbfa
l/PPART2。核心结合因子al(Cbfa 1)是诱导成骨细胞转录的特异性因子,过氧 化物酶增殖体激活受体y2(PPAR3,2)主要存在于脂肪细胞,可引起MSCs向脂肪

细胞分化,糖皮质激素通过卜.调Cbfa lmRNA的表达和上调PPAR72mRNA的表达
而抑制成骨细胞分化,促进MSCs[甸脂肪细胞分化,髓腔内脂肪填塞导致股骨头

m液循环*钩晒窍赴只⒃鲋衬芰ο陆怠

附录B综述

6前景及展望
股骨头缺血性坏死的确切发病机制目前尚未完全阐明,其病因可能与创伤、 糖皮质激素使用、过度饮酒、减压病、*系统疾病、病毒感染等因素有关,随 着疾病的进展,可引起髋关节变形和骨性关节炎,严重影响患者生活质量,因此, 在疾病早期应采取积极的治疗方法来缓解或治愈疾病,最终达到保留患者股骨头 或延缓行人工髋关节置换术的目的。中药是祖国的传统瑰宝,资源丰富,中药 防治ONFH有着悠久的历史,在治疗上积累了丰富的经验,并已显示出一定优势;

现代中药提取技术能最大限度地保留中药的有效成分,为中医药的进一步发展
打下了坚实的基础;MSCs具有的强大增殖扩增能力和多向分化潜能的生物学特 性,其来源不受限制,取材方便,对供体损伤小,易于分离,大量传代后仍能 保持其生物学特性;中药在MSCs的扩增、定向分化的调控等方面都有其独特

的作用,既可直接作用于体内的MSCs,促进其增殖、分化,也可影响其微环境,
促进其存活与功能的建立。正是基于上述原因,将中药结合MSCs治疗ONFH预

示着良好的前景。但是目前的研究仅限于动物实验,而且多采用中药单体或单 昧中药作为研究对象,对成方的研究甚少,中药的筛选以及其有效成分的确定 都需要做大量的实验工作。因此,如何发挥中西医结合治疗ONFH的独特优势,
从组织水*、分子水*和基因水*探讨中药结合MSCs治疗ONFH的分子机制, 从而过渡到人体实验,为ONFH的治疗开辟新的途径,使其在生命科学的研究前 沿占有一席之地,造福于广大ONFH患者。

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攻读学位期间的研究成果

攻读学位期间的研究成果
已发表论文:
[1】陈伟才,罗军.股骨头坏死的治*梗窖в胝苎В玻埃埃福玻梗ǎ叮海担矗担罚 【2】陈伟才,罗军.杜仲叶提取物诱导羊骨髓问充质干细胞成骨及抑制其成脂肪分化.中国 组织:f:程研究与临床康复,2009,13(10):1160.1164.

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杜仲叶提取物诱导羊骨髓间充质干细胞成骨及抑制成脂肪分 化的实验研究
作者: 学位授予单位: 陈伟才 南昌大学医学院

本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Thesis_Y1544391.aspx


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